桂芍鎮癇片由白芍、黨參、柴胡等9味中藥組方而成,用于治療各種發作類型的癲癇,為《衛生部藥品標準•中藥成方制劑》第3冊收載的品種(WS3-B-2591-97)。原質量標準中只有黃芩、白芍的鑒別,無含量測定。為了更好地控制本品質量,本試驗對其質量標準進行了研究。采用薄層色譜(TLC)法對制劑中的甘草、黨參及柴胡進行了鑒別,采用高效液相色譜(HPLC)法對制劑中君藥白芍的主要成分芍藥苷進行了含量測定。

    1 儀器與試藥

    LC-20AT高效液相色譜儀,包括SPD-20A檢測器、Labsolution色譜數據處理工作站(日本島津)；賽多利斯電子天平(1/100 000,德國)；KQ-250DE數控型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

    甘草次酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號110723-200411)；黨參對照藥材(供鑒別用,中國藥品生物制品檢定所,批號121057-200303)；柴胡對照藥材(供鑒別用,中國藥品生物制品檢定所,批號120992-0301)；芍藥苷對照品(供含量測定用,中國藥品生物制品檢定所,批號110736- 200423)；桂芍鎮癇片樣品(自制,批號060811、060812、060813)。乙腈為色譜純,水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

    2 定性鑒別

    2.1 甘草的鑒別

    取本品10片,除去薄膜衣,研細,稱取細粉3 g,加氯仿40 mL, 回流提取30 min,濾過,濾渣揮干溶劑,加甲醇40 mL,回流提取1 h,濾過,濾液蒸干,殘渣加水30 mL使溶解,用水飽和的正丁醇提取3次,每次20 mL,合并正丁醇液,用正丁醇飽和的水洗滌2次,每次20 mL,合并正丁醇液,蒸干,殘渣加甲醇1 mL使溶解,作為供試品溶液。另取甘草次酸對照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國藥典》2005年版(一部)附錄ⅥB]試驗,吸取供試品溶液5～10 μL、對照品溶液4 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(30～60 ℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(10∶20∶7∶0.5)為展開劑[1],展開,取出,晾干,噴以10 %磷鉬酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。

    2.2 黨參的鑒別

    取本品10片,除去薄膜衣,研細,稱取細粉3 g,加正丁醇50 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液濃縮至約0.5 mL,作為供試品溶液。另取黨參對照藥材2 g,加水20 mL,微沸煮40 min,濾過,濾液用正丁醇30 mL振搖提取,正丁醇液濃縮至1 mL,作為對照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國藥典》2005年版(一部)附錄ⅥB]試驗,吸取供試品溶液和對照藥材溶液各5 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以正丁醇-無水乙醇-水(15∶3∶2)為展開劑[2],展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇,于105 ℃下加熱。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。

    2.3 柴胡的鑒別

    取本品10片,除去薄膜衣,研細,稱取細粉3 g,置具塞錐形瓶中,加甲醇50 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加水30 mL使溶解,并轉移到分液漏斗中,用水飽和的正丁醇提取3次,每次40 mL,合并正丁醇液,用氨試液40 mL洗滌,棄去氨液,正丁醇層蒸干,殘渣加甲醇1 mL使溶解,作為供試品溶液。取柴胡對照藥材1 g,加水微沸30 min,濾過,濾液濃縮至約30 mL,轉移至分液漏斗中,余項操作同供試品,即得對照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國藥典》2005年版(一部)附錄ⅥB]試驗,吸取供試品溶液和對照藥材溶液各10 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)為展開劑[3],展開,取出,晾干,噴以10%磷鉬酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。

    3 含量測定

    3.1 色譜條件與系統適用性

    色譜柱為DiamonsilTMC18(5 μm,200 mm×4.6 mm)；流動相為乙腈-0.1%醋酸溶液(15∶85),流速為1.0 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為室溫。理論板數按芍藥苷峰計算應不低于4 000；分離度R＞1.5。

    3.2 溶液的制備

    3.2.1 對照品溶液

    精密稱取芍藥苷對照品12.26 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇適量使溶解,定容,搖勻,精密量取5.0 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,經0.45 μm濾膜濾過,即得。

    3.2.2 供試品溶液

    取桂芍鎮癇片10片,除去薄膜衣,研細,取細粉0.2 g,精密稱定,置50 mL量瓶中,加稀乙醇35 mL,超聲處理((功率250 W,頻率40 kHz),放冷,加稀乙醇定容,搖勻,濾過,取續濾液,經0.45 μm濾膜濾過,即得。

    3.2.3 陰性對照品溶液

    按處方組成及制備工藝制備不含芍藥的樣品,按“3.2.2”項下方法處理,即得。

    3.3 空白干擾試驗

    按上述色譜條件,分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液,注入液相色譜儀,測定。結果在供試品色譜中,在與對照品色譜峰相應的位置上有相同保留時間的色譜峰,而陰性對照品溶液在此無峰,見圖1。芍藥苷與其他組分分離良好,說明陰性樣品對芍藥苷含量測定無干擾。

    3.4 線性范圍考察

    精密吸取對照品溶液4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μL,按上述色譜條件測定,記錄色譜圖,以峰面積為縱坐標,進樣量為橫坐標,進行線性回歸,得回歸方程為：Y＝1 547 954X＋14 289 (r＝0.999 7)。結果表明,芍藥苷在0.245 2～0.735 6 μg范圍內線性關系良好。

    3.5 精密度試驗

    精密吸取對照品溶液10 μL,按上述色譜條件重復進樣5次,記錄色譜圖,計算。結果RSD＝0.81%,表明本法精密度較好。

    3.6 穩定性試驗

    精密吸取供試品溶液10 μL,按上述色譜條件測定,分別于0、4、8、12、24 h進樣,記錄色譜圖,測定峰面積,計算。結果RSD＝1.04%,表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

    3.7 重復性試驗

    取同一批樣品(批號060811)5份,按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測定,記錄色譜圖,測定峰面積,計算。結果本品平均含量為13.06 mg/g(RSD＝1.10%),表明本方法重復性良好。

    3.8 加樣回收率試驗

    取已知含量的樣品(批號060811,含量13.06 mg/g),除去薄膜衣,研細,取0.1 g,精密稱定,置50 mL量瓶中,精密加入芍藥苷對照品溶液10 mL(濃度為0.122 6 mg/mL),其余按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測定,記錄色譜圖,計算,結果見表1。本方法回收率在96.7%～100.3%之間,RSD＝1.52%,表明方法的準確性較好。

    3.9 樣品測定

    取3個批號(060811、060812、060813)的樣品,平行2份,按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液。精密量取對照品、供試品溶液各10 μL,按上述色譜條件測定,測定峰面積,計算。結果3個批號樣品中芍藥苷的平均含量分別為4.12、4.09、4.08 mg/片。

    4 討論

    曾試驗了甲醇-0.1 %磷酸溶液(35∶65)、甲醇-水(30∶70)及乙腈-0.1%醋酸溶液(25∶75)等流動相系統,結果均不理想。而流動相為乙腈-0.1%醋酸溶液(15∶85)時,具有較好的分離度和適宜的保留時間,故以此作為含量測定的流動相。

    在篩選樣品中芍藥苷的提取條件時,比較了稀乙醇加熱回流法和超聲提取法,結果超聲提取方便、迅速,超聲30 min即可提取完全,故樣品的處理采用超聲提取30 min。

    以TLC法對制劑中的甘草、黨參及柴胡進行定性鑒別,斑點清晰,專屬性好,無陰性干擾。芍藥苷為白芍中的主要成分,可用來作為中成藥中白芍的定量指標成分。所建立的HPLC法測定芍藥苷含量簡便、重復性好,可作為控制本品質量的指標。

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