70年以來國內(nèi)外一系列研究證明靈芝[Ganoderma lucidum(Leyss。ex Fr。)Karst。] 對(duì)動(dòng)物移植性腫瘤具有抑制作用，可使瘤重減輕，生存時(shí)間延長(zhǎng)。并認(rèn)為靈芝多糖可能是靈芝抗腫瘤作用的重要有效成份[1]。然而，靈芝的抗腫瘤作用是如何產(chǎn)生的？靈芝是直接殺死腫瘤細(xì)胞，還是像一些學(xué)者推測(cè)的那樣：靈芝是通過機(jī)體內(nèi)部的抗腫瘤機(jī)制間接殺死腫瘤細(xì)胞，這些均是目前學(xué)術(shù)界關(guān)注的焦點(diǎn)。為此，我們采用體內(nèi)外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)方法和細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)以及血清藥理學(xué)方法探討了靈芝的抗腫瘤作用及其機(jī)制。

 

　　1 靈芝的體內(nèi)抗腫瘤作用　　給Blab/c 小鼠皮下接種肉瘤S-180后，灌胃靈芝提取物（GLE）5、10、20g（生藥）/kg，共10d，可顯著抑制S-180肉瘤生長(zhǎng)，其抑瘤率分別為22。77%、41。58%和60。89%[2]。同樣，灌胃靈芝多糖B（GL-B）50、100、200mg/kg ，共10d，也可抑制Balb/c小鼠S-180生長(zhǎng)，抑瘤率分別為27。70%、55。83%和66。70%。GL-B與環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide,Cy）并用還能增強(qiáng)后者的抗腫瘤作用[3]。我們還發(fā)現(xiàn)靈芝菌絲體多糖50、100mg/kg 可顯著抑制Balb/c 小鼠和昆明種小鼠移植性肉瘤S-180 生長(zhǎng)，其抑瘤率分別為52。86%、78。10%和37。78%、61。79%。以上結(jié)果證明，靈芝及其所含多糖在小鼠體內(nèi)具有抗腫瘤作用。

 

　　2 靈芝在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用　　靈芝在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞是否有直接抑制作用？我們將濃度為50、100、200mg（生藥）/mL 的GLE加至體外培養(yǎng)的S-180 細(xì)胞培養(yǎng)基中， 用MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性，結(jié)果GLE對(duì)S-180細(xì)胞的增殖并無直接抑制作用（見表1）[3]。同樣，將GL-B（50～200mg/L）直接加入到人白血病細(xì)胞（HL-60）培養(yǎng)基中，GL-B對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖亦無顯著抑制作用。靈芝菌絲體多糖（5。9～750mg/L）對(duì)HL-60細(xì)胞在體外生長(zhǎng)也無抑制作用[3]。這些結(jié)果指出，靈芝及其所含多糖并不能直接抑制或殺死腫瘤細(xì)胞，即它們并非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥。靈芝雖不能直接殺死腫瘤細(xì)胞，但它是否能像一些抗腫瘤藥那樣誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡？細(xì)胞凋亡（apoptosis）是一種細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，目前發(fā)現(xiàn)，一些抗腫瘤藥如烷化劑、抗代謝藥、抗激素藥等均能通過誘導(dǎo)對(duì)其敏感的腫瘤細(xì)胞株的凋亡而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。靈芝是否能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡？我們采用瓊脂糖凝膠電泳法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)法觀察靈芝對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)濃度為50～100mg（生藥）/mL 時(shí)， GLE不能直接誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的S-180細(xì)胞凋亡（表1）。GL-B（50～200mg/L）亦不能直接誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡[2，3]。而靈芝菌絲體多糖即使?jié)舛雀哌_(dá)600mg/L ， 也不能直接誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡[4]。以上結(jié)果指出靈芝及其所含多糖既不能直接抑制或殺死腫瘤細(xì)胞，又不能直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。靈芝在體內(nèi)的抗腫瘤作用又是如何產(chǎn)生的呢？

 

　　3 靈芝抗腫瘤作用的血清藥理學(xué)研究　　血清藥理學(xué)試驗(yàn)是指給試驗(yàn)動(dòng)物灌服中藥后，取服藥動(dòng)物的血清，即含藥血清代替中藥進(jìn)行體外試驗(yàn)的方法。含藥血清中可能含有所服中藥或其活性代謝產(chǎn)物，也可能含有在中藥作用下產(chǎn)生的內(nèi)源性活性物質(zhì)， 并因此而產(chǎn)生藥理作用。為了探討靈芝及其所含多糖在體內(nèi)的抗腫瘤作用機(jī)制， 我們采用了血清藥理學(xué)方法進(jìn)行了以下研究：給小鼠灌胃GLE5、10、20g（生藥）/kg，共10d， 最后一次給藥后1h， 取血，無菌分離血清，經(jīng)56℃，30min滅活處理后，并經(jīng)微孔濾膜過濾除菌，置-20℃保存?zhèn)溆�。將此含GLE血清加至體外培養(yǎng)的S-180細(xì)胞中，可明顯抑制S-180細(xì)胞生長(zhǎng)并可誘導(dǎo)S-180細(xì)胞凋亡（見表1）[2]。與以上結(jié)果相似，經(jīng)小鼠灌胃不同劑量的GL-B后，取出小鼠的血清（含GL-B血清），并觀察此血清在體外對(duì)HL-6細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果可見含GL-B血清可顯著抑制HL-60 細(xì)胞增殖并明顯地誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡[3]。結(jié)果提示，小鼠灌服GLE或GL-B后血清中可能出現(xiàn)了一種有抗 腫瘤活性的物質(zhì)。究竟是什么物質(zhì)？我們又分別采用生物法和ELISA方法，檢測(cè)GLE血清中TNFa的活性和IFNg的含量。TNFa活性測(cè)定用L929細(xì)胞結(jié)晶紫染料攝入法。TNFa可使小鼠成纖維細(xì)胞株L929細(xì)胞死亡，用結(jié)晶紫染料可使活細(xì)胞著色，加入細(xì)胞裂解劑SDS， 可使染料從細(xì)胞內(nèi)脫出顯色，通過酶標(biāo)儀直接進(jìn)行比色測(cè)定，反映細(xì)胞的存活狀態(tài)，從而間接反映TNFa的活性，OD值越小反映TNFa的活性越大。IFNg的測(cè)定采用小鼠IFNg ELISA 試劑盒測(cè)定，該法可準(zhǔn)確定量。結(jié)果顯示，GLE5、10、20g（生藥）/kg或GL-B 50，100，200mg/kg灌胃小鼠血清中TNFa的活性隨GLE或GL-B的劑量增加而增強(qiáng)，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系[2，3]。相同劑量處理小鼠血清中IFNg的含量亦顯著增加（見表2、表3）。已知TNFa和IFNg對(duì)腫瘤細(xì)胞均具有細(xì)胞毒作用，TNFa在體外可誘導(dǎo)多種不同來源的腫瘤細(xì)胞凋亡，因此，含GLE或GL-B血清在體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，至少與其中所含TNFa和IFNg有關(guān)，而后二者是在GLE或GL-B作用下，在體內(nèi)生成的。而IFNg還可與TNFa協(xié)同作用使后者誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)。表1　GLE和含GLE血青對(duì)S-180細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

 

      4 靈芝與巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞共同培養(yǎng)上清液對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響　　為了進(jìn)一步探討靈芝多糖的抗腫瘤作用機(jī)制。我們?cè)谛∈蟾骨痪奘杉?xì)胞培養(yǎng)中，加入濃度為50、100、200mg/L 的GL-B共同培養(yǎng)24h，然后取共培養(yǎng)上清液（GL-B-PM-CM）加至HL-60細(xì)胞培養(yǎng)基中，可顯著抑制HL-60 細(xì)胞增殖和促其凋亡[2，3]�！　∵@一結(jié)果提示，在GL-B作用下，共培養(yǎng)上清液中出現(xiàn)一種能抑制HL-60細(xì)胞增殖并促其凋亡的活性物質(zhì)，是否就是前述試驗(yàn)中的TNFa？我們進(jìn)一步用生物法檢測(cè)培養(yǎng)上清中TNFa的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GL-B確有誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNFa的作用， 并呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。同上劑量的GL-B與小鼠脾細(xì)胞共同培養(yǎng)上清（GL-B-S-CM）亦能顯著抑制HL-60細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，這一作用也和GL-B與小鼠脾細(xì)胞共同培養(yǎng)上清中INFg含量增加一致。同樣，濃度為12。5、50、200mg/L的靈芝菌絲體多糖與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24h，共培養(yǎng)上清液可顯著抑制HL-60細(xì)胞增殖，并促其凋亡。與此同時(shí)，上清液中TNFa的分泌亦明顯增加[5]。Wang等（1997）將靈芝子實(shí)體多糖PS-G直接加入白血病細(xì)胞株HL-60和V937細(xì)胞培養(yǎng)中，既不能抑制此二細(xì)胞株增殖，也不能誘導(dǎo)此二細(xì)胞株凋亡。但在此二細(xì)胞培養(yǎng)中，加入20%（vol/vol）PS-G與人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)液則可顯著抑制此二細(xì)胞增殖，并促其凋亡。進(jìn)一步研究還證明，在健康人外周血單核細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中加入PS-G，可明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞生成IL-1b、TNFa和IL-6以及T淋巴細(xì)胞生成IFNg[6]，這些結(jié)果均說明靈芝多糖確能直接作用于巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，促其產(chǎn)生TNFa和IFNg等細(xì)胞因子，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞或促其凋亡。

 

　　5 靈芝對(duì)巨噬細(xì)胞TNFa mRNA 和脾細(xì)胞 IFNg mRNA 表達(dá)的影響　　為了進(jìn)一步在分子水平觀察GL-B促進(jìn)TNFa生成的機(jī)制，我們進(jìn)一步研究了GL-B對(duì)此二細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響，即在小鼠巨噬細(xì)胞或脾細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的GL-B，培養(yǎng)1～2d后用TRIZOL試劑提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，加入相應(yīng)的細(xì)胞因子或內(nèi)對(duì)照b-actin引物和RT-PCR反應(yīng)體系，置PCR儀中擴(kuò)增，瓊脂糖電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，并用圖像分析儀對(duì)擴(kuò)增的泳帶進(jìn)行輝度分析。結(jié)果表明GL-B可顯著促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNFa mRNA和脾細(xì)胞IFNg mRNA的表達(dá)水平（見表4）。在體內(nèi)給藥的條件下，靈芝是否也能促進(jìn)這些細(xì)胞因子的mRNA 表達(dá)？我們給小鼠灌胃GLE5g（生藥）/kg、10g（生藥）/kg、20g（生藥）/kg，共10d，取小鼠的巨噬細(xì)胞或脾細(xì)胞，按前法測(cè)TNFa mRNA或IFNg mRNA表達(dá)。結(jié)果可見，給小鼠灌胃GLE可顯著增加小鼠巨噬細(xì)胞TNFa mRNA表達(dá)和脾細(xì)胞IFNg mRNA表達(dá)（見表5）[7，8]。　　

 

      綜上所述，靈芝在體內(nèi)對(duì)小鼠移植性腫瘤有抗腫瘤作用，但對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞無直接抑制作用。加之，靈芝能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，如增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型過敏反應(yīng)、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞的功能、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能、促進(jìn)白介素1（IL-1）、白介素2（IL-2）和白介素6（IL-6）的生成等[1]，故推測(cè)靈芝的抗腫瘤作用可能是由機(jī)體免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的。我們的研究證明：靈芝及其所含多糖在體內(nèi)可直接作用于巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞，促進(jìn)TNFa mRNA和IFN g mRNA 表達(dá)，增加TNFa和IFNg的生成， 并因此而殺死腫瘤細(xì)胞。