黃岑甙是中藥黃岑中的一種黃酮類化合物，臨床上許多清熱解毒和抗菌消炎的中成藥中都含有黃岑甙。近年來的研究表明，黃岑中的黃酮成分還有抗癌和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋謝的作用。Powell等的研究表明，黃岑水提物對卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞具有抑制再生作用，并抑制細(xì)胞高表達(dá)Bcl-2,。我們在Wistar大鼠腦深部復(fù)制膠質(zhì)瘤模型，并給予黃岑甙治療，分析治療后大鼠腦膠質(zhì)瘤的病理學(xué)和影像學(xué)檢驗結(jié)果，以及大鼠平均生存的時間和體重變化情況，評價黃岑甙治療在體腫瘤的效果，探討其可能的作用機(jī)制。

　　材料與方法
　　一、材料
　　1. 細(xì)胞系：C6細(xì)胞系由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院神經(jīng)神經(jīng)外科研究所提供，37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。
　　2. 實驗動物：雄性Wistar大鼠32只，鼠齡6~8周，體重250`280g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院動物室提供。
　　3. 藥物：黃岑甙（純度為98%，分子量為446.35），由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部提供。
　　4. 試劑與儀器：小牛血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，血卟啉單甲醚（HMME）由第二軍醫(yī)大學(xué)提供，p53單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體、SABC制劑盒、DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司，釓噴酸葡胺（Gd-DTPA）購自德國先上海靈公司，戊巴比妥鈉為上海化學(xué)制劑廠產(chǎn)品。Visart1.5T MRI機(jī)（日本東藝公司），江灣型立體定向儀（上海奧爾科特生物科技有限公司），Relchert-Jung超薄切片機(jī)（德國徠卡公司），JEM-1220透射電子顯微鏡（日本電子公司）。

　　二、方法
　　1. 細(xì)胞培養(yǎng)：將C6膠質(zhì)癌細(xì)胞以含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代時間為2~3d。選擇對數(shù)生長長期細(xì)胞進(jìn)行分組實驗。
　　2. 建立大鼠腦膠質(zhì)癌模型：參考文獻(xiàn)的方法復(fù)制Wistar大鼠腦深部膠質(zhì)癌模型。將健康Wistar大鼠，以1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于立體定向儀頭架上，術(shù)區(qū)消毒，切開頭皮，暴露顱骨標(biāo)志。接種靶點為大鹵中點前1.0mm，矢狀縫右旁開3.0~3.5mm，硬膜下5mm。行顱骨鉆孔，立體定向引導(dǎo)下微量注射接種C6細(xì)胞（吸入15µl C6細(xì)胞懸液，含1×106個C6細(xì)胞，細(xì)胞存活率>95%）。注射時間>10mm，留針5mm后緩慢退出，骨蠟封閉顱骨，縫合頭皮，自由進(jìn)食水。選擇接種后7d的大鼠作為本實驗?zāi)X膠質(zhì)癌模型。
實驗分組;32只Wistar大鼠接種C6細(xì)胞后7d，隨機(jī)分為實驗組和對照組。實驗組24只，分為小劑量組（50mg.kg-1.d-1）8只，中劑量組劑量組（100mg. kg-1.d-1）8只，大劑量組（200mg. kg-1.d-1）8只，給予黃岑甙灌胃；對照組8只，給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，30mg. kg-1.d-1。
　　3. 一般狀態(tài)和生存期觀察：每天觀察大鼠意識、接觸反應(yīng)、運(yùn)動狀態(tài)、顱神經(jīng)癥狀、視覺反應(yīng)、偏癱、蒼老和癲癇等一般情況。每天測量大鼠體重，記錄大鼠的死亡日期。死亡以自然死亡或瀕死前處死為標(biāo)準(zhǔn)，計算大鼠的生存期。
　　4. MRI動態(tài)觀察：大鼠接種C6細(xì)胞后7天、第14天和第21天，腹腔注射Gd-DTPA后行增強(qiáng)掃描。
　　5. 病理學(xué)檢查：麻醉開顱后取腫瘤組織，4%甲醛固定，常規(guī)光鏡、電鏡標(biāo)本制作，觀察。
　　6. 免疫組織化學(xué)：采用SABC法，觀察大鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞癌p53和Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果判斷Bcl-2表達(dá)陽性為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，細(xì)胞核呈明顯的棕色反應(yīng)為p53表達(dá)陽性。染色強(qiáng)度分為4級：陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≤5%為陰性（—）；6%~25%為陽性（+）；26%~50%為中度陽性（++）；51%~100%為強(qiáng)陽性（+++）。

　　三統(tǒng)計學(xué)習(xí)方法
　　采用SAS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，單變量兩組資料之間的比較采用t檢驗，多組資料之間的采用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)ɑ=0.05。

　　結(jié) 果
　　大鼠的一般狀態(tài)和生存情況：大鼠初期無明顯癥狀，從第3天開始，運(yùn)動量逐漸減少，攻擊性下降。對照組和小、中劑量組分別從第9、11、15天開始飲水進(jìn)食減少，出現(xiàn)皮毛不整潔，精神萎靡:從第12、14、18天開始，逐漸有大鼠出現(xiàn)左側(cè)或雙側(cè)肢體無力，進(jìn)行性加重。后期出現(xiàn)面容蒼老，眶周出血，刺激反應(yīng)減弱甚至呈木僵狀，偶有癲癇發(fā)作。瀕死前表現(xiàn)為極度惡液質(zhì)，呼吸衰弱。而大劑量組上述情況出現(xiàn)較晚。

　　接種后，大鼠早期體重大多無明顯下降，甚至呈現(xiàn)輕微的上升趨勢，一般在第7天（對照組）、第8天（小劑量組）和第10天（中劑量組），大鼠的平均體重逐漸減輕，并隨著時間推移出現(xiàn)明顯下降，在瀕死前最低。在同時間大劑量組大鼠體重明顯下降緩慢或不下降。

　　１．小、中、大劑量組和對照組大鼠的生存時間分別為（24.14±4.01）d、（25.37±3.96）d、（42.83±4.77）d、和（23.49±3.84）d。小、中劑量組與對照組大鼠的生存時間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）；大劑量組與對照組大鼠的生存時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

　　2．大鼠腫瘤的大體狀態(tài)：各組大鼠處死（瀕死）前腫瘤的體積。小、中劑量組與對照組大鼠的腫瘤體積比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）;大劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

　　大鼠腫瘤的MRI表現(xiàn)顯示，接種C6細(xì)胞后，所有大鼠右側(cè)尾殼核均有強(qiáng)化后的短T1、長T2占位信號影，提示有腫瘤生長。在腫瘤接種后7d，即分組治療前，各組大鼠腫瘤平均直徑為3.00mm。在黃芩甙治療后各時間點，各治療組大鼠腦內(nèi)腫瘤直徑增長較對組減慢，大劑量組大鼠處死（瀕死）前腫瘤最大徑和腫瘤體積均明顯低于對照組（均P<0.01）。對照組腫瘤生長迅速，腫瘤中心存在存在不強(qiáng)化的中心壞死區(qū)、強(qiáng)化環(huán)和周圍水腫區(qū)；中、大劑量治療組腫瘤未見明顯壞死區(qū)，腫瘤體積增長減慢，大劑量組可見腫瘤體積縮小。

　　大鼠腫瘤組織的病理學(xué)特點：各組大鼠大體病理均可見右側(cè)尾狀核腫瘤。新鮮標(biāo)本可見，腫瘤組織較周圍正常腦組織顏色深、無包膜、邊界不清、呈灰黃色、魚肉狀，有較多的新生血管，腫瘤向周圍腦組織浸潤性生長，周圍腦組織水腫，中線結(jié)構(gòu)向?qū)��?cè)移位。大多數(shù)腫瘤切面可見出血或壞死。

　　腫瘤組織HE染色顯示，對照組可見生長活躍的瘤細(xì)胞密集成群，部分腫瘤細(xì)胞圍繞增生小血管或壞死灶云集在一起，呈花環(huán)狀，在瘤組織邊緣可見大量增生的毛細(xì)血管，向腦組織浸潤生長，但無包膜形成，癌組織中可見灶性出血、壞死，癌細(xì)胞異形性明顯，體積較大，呈圓形或多角形，胞質(zhì)紅染，細(xì)胞核大深染，核分裂象多見，亦可見壞死細(xì)胞，細(xì)胞膜不完整，細(xì)胞核很淡甚或消失，周邊可見出血灶；大劑量組腫瘤組織可見癌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，腫瘤細(xì)胞壞死，細(xì)胞質(zhì)溶解，僅剩核碎片堆積在一起。

　　腫瘤組織透射電鏡觀察顯示，接種21天，對照組可見腫瘤細(xì)胞生長活躍，細(xì)胞形態(tài)圓形或不規(guī)則，細(xì)胞表面可見微絨毛結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核圓形或不規(guī)則形，核內(nèi)易染質(zhì)較多。大劑量組腫瘤接種第21天，可見細(xì)胞表面微絨毛明顯減少，伸出偽足樣物質(zhì)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核膜下染色質(zhì)輕度邊集，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)形成明顯的斑塊，細(xì)胞核畸變明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張脫顆粒，線粒體減少，部分線粒體嵴膜形成髓樣變，細(xì)胞膜完全破裂，無細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。

　　免疫組化染色結(jié)構(gòu)顯示，在C6膠質(zhì)癌細(xì)胞中，p53蛋白定位于細(xì)胞核，呈棕色著色，陽性細(xì)胞密度高，數(shù)量多。Bcl-2在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕黃色顆粒，陽性細(xì)胞密度高，數(shù)量多。對照組p53蛋白強(qiáng)陽性細(xì)胞百分百為（84.47±3.74）%，中度陽性細(xì)胞百分比為（47.28±2.38）%，與陰性細(xì)胞百分比 [（12.91±1.07）%]比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）；大劑量組p53蛋白強(qiáng)陽性細(xì)胞百分比與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）。對照組Bcl-2蛋白強(qiáng)陽性細(xì)胞百分百為（86.51±4.17）%，中度陽性細(xì)胞百分比為（48.19±2.11）%，與陰性組[(10.36±1.43)%]比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均p<0.01）.

　　討論
　　近年來，中藥在腫瘤治療方面取得了一定的成績，特別是在增強(qiáng)免疫、整體調(diào)節(jié)方面。通過研究中藥抗腫瘤的組方特點，提示我們開發(fā)抗腫瘤中藥新藥，可堅持攻補(bǔ)雙施、聯(lián)合用藥的原則，有研究表明，黃岑甙具有很好的抗腫瘤作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

　　細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡是在內(nèi)外因素誘導(dǎo)下出現(xiàn)的一種自發(fā)的死亡過程，是一個主動、高度有序、基因控制以及一系列酶參與的過程。有研究表明，細(xì)胞凋亡過程的異常和紊亂與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為當(dāng)今腫瘤治療的熱點之一。

　　p53、Bcl-2、c-myc和fas等基因是細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的調(diào)控位點，而p53和Bcl-2在凋亡過程作用顯著。p53是重要的抑癌基因，分為野生型和突變型。突變型P53蛋白在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，半衰期長，通過免疫組化可以檢測。而野生型p53，因其半衰期短，通過免疫組化很艱難檢測，但可誘導(dǎo)DNA損傷，使不能修復(fù)的細(xì)胞發(fā)生凋亡，防止具有癌變傾向的基因突變細(xì)胞產(chǎn)生，從而發(fā)揮其抑癌作用。Bcl-2是凋亡的抑制基因，其過度表達(dá)能增高細(xì)胞對大多數(shù)DNA損傷因子的抵抗性，抑制大多數(shù)化療藥物所引起的靶細(xì)胞凋亡，但其本身并不能抑制這些因素對細(xì)胞的損傷，也不能促進(jìn)DNA修復(fù)。p53是DNA損傷的一個分子傳感器，已經(jīng)證實Bcl-2能抑制p53介導(dǎo)凋亡，但不能抑制p53向核內(nèi)轉(zhuǎn)位或者p53介導(dǎo)的生長停滯，可能Bcl-2的作用是在DNA損傷后，阻止激活凋亡機(jī)制的信號到達(dá)其靶分子。

　　既往的研究結(jié)果顯示，黃岑甙對培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，它主要作用于細(xì)胞核，破壞核結(jié)構(gòu)。黃岑甙抑制野生型p53表達(dá)，干擾DNA合成，使細(xì)胞阻滯在C0/C1期，并激發(fā)細(xì)胞凋亡途徑，使細(xì)胞死亡。Ueda等研究表明，黃岑甙通過線粒體途徑來誘導(dǎo)caspase-3活化和細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)DNA遭受急性損害或有致癌信號時，野生型p53可以暫時或永久阻止細(xì)胞分裂，停止其進(jìn)展。在個別情況下，為了預(yù)防腫瘤的發(fā)生，野生型p53可以使變異細(xì)胞產(chǎn)生自殺效應(yīng)。最新研究表明，這種效應(yīng)是通過轉(zhuǎn)錄激活域（transactivation domain,TAD），即TAD1和TAD2相互調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。同時，該效應(yīng)還可使正常細(xì)胞免受化療或放療引起的巨大損傷性負(fù)作用。有研究表明，在低度惡性星形細(xì)胞癌中，p53突變細(xì)胞在腫瘤組織中所占比例很小，但隨著惡性度增加，p53突變的細(xì)胞數(shù)量不斷增加，表明腦膠質(zhì)癌在組織學(xué)上由低度惡性到高度惡性程度的進(jìn)展可能源于某些細(xì)胞的克隆增殖。在腫瘤發(fā)生的早期，發(fā)生p53突變的細(xì)胞所占比例小，不足以出現(xiàn)高度惡性度的表型，隨著惡性程度增加，P53突變的細(xì)胞數(shù)量不斷增加，使腫瘤惡性增殖并增加復(fù)發(fā)的機(jī)會。大量證據(jù)表明，許多抗腫瘤藥物殺傷腫瘤細(xì)胞是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的，其效能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力密切相關(guān)。提高腫瘤細(xì)胞凋亡率或逆轉(zhuǎn)其凋亡抗性，就有可能提高化療效果。多藥耐藥（multidrug resistance,MDR）是腫瘤藥物治療的主要障礙之一，而細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因的突變導(dǎo)致細(xì)胞凋亡功能的異常也是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐受性的機(jī)制之一。Bcl-2的突變可抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性；p53突變可可大大降低腫瘤細(xì)胞對輻射以及抗癌藥物易感性，提高細(xì)胞損傷刺激細(xì)胞凋亡的閾值，因此，臨床耐藥與凋亡有關(guān)。

　　我們采用免疫組化染色方法檢測大鼠C6膠質(zhì)癌p53和Bcl-2蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，C6膠質(zhì)癌突變型p53和Bcl-2呈高表達(dá)，大劑量黃岑甙可抑制突變型p53高表達(dá)，但不能抑制Bcl-2高表達(dá)，與細(xì)胞檢測結(jié)果一致，提示黃岑甙可通過抑制p53高表達(dá)而阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，激活細(xì)胞凋亡通路。膠質(zhì)癌本身是一種侵襲性生長的腫瘤，采用手術(shù)切除后，腦內(nèi)殘留的細(xì)胞大為減少，但部分殘余細(xì)胞仍為存在，此時就需要化療殺傷殘存的惡性腫瘤細(xì)胞。黃岑甙作為黃岑提取物中的一種有效成分，對多種腫瘤有抑制增殖作用。本研究結(jié)果顯示，黃岑甙能明顯抑制C6膠質(zhì)癌生長，延長動物生存時間。黃岑甙是否存在其他的作用機(jī)制抑制膠質(zhì)癌，尚有待進(jìn)一步研究。（來源：中華腫瘤雜志2013年1月 第35卷 第1期《黃岑甙對大鼠腦膠質(zhì)癌的抑制作用》胡永珍 王殿洪 欒或 龔海東）

TAG：黃岑甙 腦膠質(zhì)癌